靶除肌抑素基因体细胞克隆蒙古羊的研究

【摘要】近几年发现的抑制骨骼肌生长的负调控因子–肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN),在遗传突变后,导致基因功能的失活,进而引起动物肌肉过度发育,肌纤维数量增多,直径增加,肌肉量急剧增加,动物表现为“双肌”眭状。于是,研究者们通过对肌抑素基因进行敲除、缺失,突变等基因修饰,来获得基因敲除的动物模型和克隆动物,以达到医学上和农业上的需求。对于本研究来说,蒙古羊是内蒙古自治区的优势物种之一,培育产肉性状优良,产肉率高的蒙古羊对于自治区的家畜育种具有重要意义。本研究选用妊娠30天的蒙古羊胎儿为材料,通过组织块贴壁法成功建立蒙古羊胎儿成纤维细胞系,用于MSTN基因的打靶实验。同时利用基因敲除技术在体外构建了针对蒙古羊MSTN基因的第三外显子缺失的敲除载体。主要构建了两个带有筛选标记的置换型载体和一个无筛选标记的TALEN敲除载体。主要结果如下1、委托华大基因测序公司对蒙古羊肌抑素基因进行测序,得到测序结果后与Genebank上发布的Ovies的MSTN基因序列进行比对,设计引物,成功克隆出蒙古羊肌抑素基因。2、设计引物,利用PCR技术,成功扩增到蒙古羊MSTN基因的两种同源长臂,大小分别为5600bp和6000bp,包括全部的exonl,intron1,exon2,intron2及部分启动子和少部分exon3同源短臂1100bp,包括部分exon3和3’非翻译区序列,然后将同源长短臂分别连入代有正负筛选标记基因的pPNTⅢ和pEGF-N1的敲除骨架载体,分别用TA克隆法和无缝克隆法成功构建了针对MSTN基因第三外显子缺失的置换型打靶载体,且酶切和测序鉴定均证明两种置换型载体构建都正确。3、构建了两个针对蒙古羊肌抑素基因第三外显子中的17个碱基突变的无筛选标记的TALEN载体(197和198)和一个针对第二外显子中的17个碱基突变的TALEN载体(199)。通过活性鉴定,验证只有两个具有敲除活性的TALEN载体(197和198)。4、通过组织块贴壁法建立蒙古羊胎儿成纤维细胞系,且细胞系的生长状态良好。将置换型载体和TALEN载体分别利用电转染和LipofectamineTM2000介导的脂质体转染蒙古羊胎儿成纤维细胞。通过药物G418筛选和无限稀释一口习惯法筛选单克隆细胞,并将得到的单细胞株部分用于鉴定是否敲除,部分冻存。之后,对筛选的单细胞株提取DNA,PCR,鉴定。将最终鉴定正确的20个TALEN基因敲除细胞株再次分别做PCR,将得到的PCR产物(即在第三外显子包括靶位点的一段基因序列)连接到pMD-191上菌落PCR,每个细胞株将随机挑选15个单菌落样品送测序，再一次鉴定是否在靶位点处有碱基的突变。最终的测序证明197中有4个双等位基因缺失碱基的细胞株,而198中只有3个细胞株发生单碱基突变或缺失。5、选择用筛选出来的双等位基因缺失的单克隆细胞株E20、P54、P66和P42(在靶位点附近分别缺失碱基19个、11个、8个和11个)做为供体细胞,成熟的卵母细胞去核后做为受体细胞,通过显微注射法构建了基因敲除的克隆重构胚,再进行胚胎移植。结果为：四种不同的细胞株共移植61只受体绵羊。经B超检测,共妊娠20只羊。6、现已出生基因敲除羔羊共11只,已检测其中4只,2只为双等位基因敲除羔羊(缺失碱基19bp),2只为单等位基因敲除,7只正在鉴定中,余2只受体待产。
【作者】赵瑞媛；
【导师】周欢敏；
【作者基本信息】内蒙古农业大学，动物发育生物学与生物技术，2014，博士
【关键词】蒙古羊；MSTN；遗传育种；基因打靶；克隆；基因敲除细胞；

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